10.12. Analitičko ultracentrifugiranje

Taloženje makromolekula i vrlo sitnih čestica različitih masa može se promatrati i fotografirati u vremenskim intervalima ako se te molekule ili npr. virusne čestice centrifugiraju u analitičkoj ultracentrifugi. Takva ultracentrifuga posjeduje optičke uređaje koji registriraju brzinu taloženja pojedinih komponenata otkrivajući nam je li uzorak homogen ili heterogen, tj. sadrži li jednu ili više različitih komponenata (sl. 10.21). Osim osnovnih parametara (npr. specifična gustoća i oblik čestica, gustoća medija i dr.), na brzinu sedimentacije općenito jako utječe i koncentracija makromolekula, odnosno čestica koje se centrifugiraju. Budući da je za analitičko centrifugiranje dovoljno imati male koncentracije uzorka, u takvim visokorazrijeđenim uzorcima međusobni je utjecaj makromolekula (čestica) malen. Na osnovi podataka dobivenih pomoću analitičke ultracentrifuge može se izračunati S-vrijednost, tj. brzina sedimentacije izražena Svedbergovom jedinicom (S): 1S =1×10—13 cms—1dyn—1, uz uvjet da se taloženje zbiva u vodi i kod 20 °C. Tako npr. brzina sedimentacije odnosno sedimentacijski koeficijent virionskih čestica TMV-a i TYMV-a iznosi oko 300 S odnosno 115 S. Na temelju S-vrijednosti može se izračunati molekularna masa makromolekula, odnosno virusnih čestica. No, budući da brzina sedimentiranja jako ovisi o kemijskom sastavu i konformaciji čestice, odnosno molekule (koja pak ovisi o pH vrijednosti medija, temperaturi i o prethodnom tretmanu), ne mogu se na temelju S-vrijednosti dobiti jako točni podaci o molekularnoj masi molekula, odnosno virusnih čestica.

10.13. Ultracentrifugiranje u gradijentu gustoće određenih tvari

S pomoću običnog visokookretajnog centrifugiranja teško je odvojiti čestice koje se međusobno malo razlikuju po brzini taloženja. Razlog tome jest činjenica što se pri određenom visokookretajnom centrifugiranju na dno epruvete istalože i lakše i teže čestice. No, takve je čestice, pa i one sličnih S-vrijednosti, moguće uspješno separirati centrifugiranjem u gradijentu gustoće nekih tvari (šećer, glicerol, cezijev klorid itd.) koji se pripravlja u destiliranoj vodi ili u puferu. Najčešće se rabi gradijent šećera (saharoza).

Centrifugiranje u gradijentu gustoće neke tvari (kraće: u gradijentu gustoće) obavlja se tako da se u epruveti, u kojoj će se uzorak centrifugirati, priredi otopina jedne od gore spomenutih tvari, npr. šećera; otopina mora od vrha prema dnu biti postupno i kontinuirano sve gušća, odnosno sve koncentriranija; u samom vrhu epruvete otopina šećera može npr. biti 5%, a na dnu epruvete 30%. Koje će se koncentracije šećera upotrijebiti, ovisi o virusnom uzorku s kojim se radi, tj. o veličini virusa, čistoći uzorka, koncentraciji uzorka itd. U epruvetu se na površinu <pb n="96"/> gradijenta stavi određena količina virusnog pripravka (od 0,8 do 1 ml uzorka koncentracije 1-2 mg/ml). Nakon toga se epruveta s uzorkom centrifugira u ultracentrifugi, i to, u pravilu, u rotoru s horizontalnim položajem epruvete u tijeku vrtnje (sl. 10.19b). Pri centrifugiranju teže će se čestice taložiti brže, dok će lakše čestice zaostajati bliže gornjeg dijela epruvete. Sve čestice iste težine zastat će u istoj visini epruvete pa ih je nakon toga lako izolirati. Prema tome, zbog toga što donji dio gradijenta ima veću gustoću od čestica centrifugiranog uzorka, pri ovakvu centrifugiranju komponente uzorka ne dospijevaju na dno epruvete.

Centrifugiranjem u gradijentu gustoće šećera virus se može odvojiti od ostalih nevirusnih čestica, tj. može se purificirati. Osim toga, takvim se centrifugiranjem mogu odvajati i različiti tipovi čestica kakve posjeduju multikomponentni virusi. Naime, čestice multikomponentnog virusa razlikuju se po brzini taloženja jer imaju različite sedimentacijske koeficijente, pa čestice iste brzine taloženja tvore u gradijentu zasebne zone koje se u epruveti vide kao tanje ili deblje bijele, opalescirajuće linije (sl. 10.22).

Separacija virusa u opisanom gradijentu gustoće šećera temelji se ponajprije na razlikama u masi heterogenih čestica. No, postoji i centrifugiranje u gradijentu gustoće u kojemu se separacija virusa, u biti, temelji samo na razlikama u gustoći čestica. U tom se slučaju načini gradijent različitih gustoća tvari (često se koristi cezijev klorid ili cezijev sulfat). To se radi tako da se u epruveti u kojoj će se uzorak centrifugirati načine odvojeni slojevi različitih gustoća tvari (npr. cezijeva klorida): od vrha prema dnu epruvete slojevi su sve gušći. Ako je riječ o uzorku koji sadrži čestice različite gustoće, svaki će tip čestice u gradijentu tijekom centrifugiranja doseći sloj svoje gustoće i dalje se neće kretati. Naime, kad se određena čestica nađe u sloju gradijenta koji ima istu gustoću kao i ona sama, ta se čestica ne može nikakvim silama istaložiti. Posljedica dosezanja svoje gustoće u takvom gradijentu bit će separacija čestica jer će se one naći u različitim gustoćama medija od kojeg je gradijent pripravljen.

Bez obzira na to o kojem je tipu centrifugiranja virusnog uzorka u gradijentu gustoće neke tvari riječ, uzorak se razdijeli u toliko frakcija koliko u njemu, s obzirom na masu ili gustoću, ima različitih tipova čestica. Te se frakcije u gradijentu mogu vidjeti i golim okom ako se epruveta s gradijentom nakon centrifugiranja osvijetli odozgo u tamnoj prostoriji.

Uspješnost separacije pojedinih frakcija (komponenata) s pomoću centrifugiranja u gradijentu gustoće uvelike ovisi o izdvajanju (izoliranju) frakcija iz gradijenta nakon centrifugiranja. To izdvajanje komponenata iz gradijenta može se činiti tako da se injekcijskom štrcaljkom probije plastična epruveta sa strane na mjestu gdje se vidi pojedina frakcija te da se zatim ta frakcija izvuče van. Druga je mogućnost da se Pasteurova kapilara, koja je na vrhu zakrivljena u obliku slova „U”, uroni odozgo kroz gradijent do željene frakcije (uz osvjetljavanje i gledanje) te se <pb n="97"/> njome frakcija izvuče napolje. Spomenuti načini izdvajanja komponenata iz gradijenta imaju, međutim, velikih nedostataka. Naime, često su frakcije u gradijentu vrlo blizu jedna drugoj, pa ih je na opisane načine teško dobiti u čistom stanju. Takvi načini izdvajanja iz gradijenta nisu osobito pogodni u radu s virusima jer frakcija jednog tipa čestica nije čista ako se u njoj nađe makar i jedna čestica iz druge frakcije (kod virusa se ispituje infekcioznost čestica pojedine frakcije). Osim toga, čest je slučaj da se pojedine frakcije, koje u uzorcima dolaze u niskim koncentracijama, ne vide golim okom kao zasebne frakcije.

Danas se izdvajanje centrifugalnih frakcija iz gradijenata izvodi s pomoću posebno načinjenih frakcionatora. Princip rada takvog frakcionatora prikazan je na slici 10.23. Kako se iz slike vidi, gradijent se, zajedno sa separiranim frakcijama, potiskuje prema vrhu epruvete, odakle on kroz usku cjevčicu dospijeva u UV-ćeliju. To se postiže tako da se pod gradijent — kroz probušeno dno epruvete — automatski i ravnomjerno uštrcava otopina tvari od koje je načinjen gradijent; ta otopina mora imati barem 10% višu koncentraciju od one na dnu gradijenta. U virološkim laboratorijima radi se uglavnom kod UV-svjetla od 254 nm. Budući da se u stupcu gradijenta nalaze frakcije koje različito intenzivno apsorbiraju UV-svjetlo od 254 nm, pisač automatski bilježi prolazak <pb n="98"/> pojedine frakcije kroz fotoćeliju; nakon protoka svih frakcija kroz UV-ćeliju dobiva se dijagram razdvojenih frakcija koji, među ostalim, pokazuje i relativnu količinu pojedine frakcije (sl. 10.24). Gledajući na krivulju koju pisač piše, pojedine se frakcije nakon protoka kroz UV-ćeliju hvataju u zasebne epruvete ili to čini automatski skupljač frakcija. Naravno da se ni na taj način ne može samo na osnovi jednog centrifugiranja odvojiti sve komponente tako da one budu posve čiste od čestica susjedne zone. Često je potrebno višekratno centrifugiranje da bi se pojedina komponenta dobila posve čista.

10.14. Spektrofotometrijska analiza virusnih pripravaka

Jedna od temeljnih fizikalnih metoda koja se primjenjuje u istraživanju virusa jest spektrofotometrijska analiza koja se osniva na tome da virusi kao nukleoproteini karakteristično apsorbiraju ultraljubičastu svjetlost u području valnih dužina između 220 i 300 nm. Ako se čista virusna suspenzija želi ispitati u spektrofotometru da bi se vidjelo kako će apsorbirati svjetlost spomenutih valnih dužina, onda će se uvijek za svaki virus dobiti apsorpcijska krivulja koja će imati vrh kod 260 nm (maksimalna apsorpcija), a udubljenje (dno) kod 240 nm (minimalna apsorpcija; sl. 10.25). Takvu krivulju, osim virusa imaju i drugi nukleoproteini. Za razliku od apsorpcijske krivulje nukleoproteina, dakle i virusa, čisti proteini imaju apsorpcijsku krivulju s vrhom kod oko 280 nm, a udubljenje kod oko 250 nm. Prema tome, već se na osnovi krivulje može saznati nalazi li se u suspenziji protein (npr. protein biljke-domaćina) ili nukleoprotein (tj. virus). Dakle, spektrofotometrom se može kontrolirati čistoća virusnog uzorka.

Važno je istaknuti da nukleinska kiselina ima donekle sličan oblik krivulje kao i virus. Nukleinska kiselina, koje inače u virusnoj čestici u usporedbi s proteinom obično ima znatno manje, apsorbira ultraljubičasto svjetlo mnogo jače od proteina. To je razlog zašto je za ukupnu apsorpciju virusa najvećim dijelom odgovorna virusna nukleinska kiselina, a ne virusni protein. Količina apsorpcije izražava se izrazom apsorbanca. Apsorbanca je log I0/I, tj. logaritam omjera između količine svjetla koje propušta otapalo (I0) i količine svjetla (I) iste valne dužine koje propušta otopina (npr. virusna otopina). Oznake su za apsorbancu optička gustoća i ekstinkcija, a simboli su kojima se označava A ili OD. Budući da svi virusi ne sadrže istu količinu nukleinske kiseline, 1 mg/ml TMV-a neće npr. imati istu apsorbancu kao 1 mg/ml virusa prstenaste pjegavosti duhana (TRSV). Ako se određuje apsorbanca kod valne dužine 260 nm koju ima TMV koncentracije 1 mg/ml, dobit će se vrijednost 3,3 (očita se na spektrofotometru). No, kod iste valne dužine ista koncentracija TRSV-a pokazat će apsorbancu 13,1.